Общая характеристика работы Актуальность работы - страница 2


Рис. 1. Показатели интенсивности свечения флюорогенного селективного бульона (ФСБ) в сравнении с показателями среды Fluorocult BRILA Broth (FBB).


^ Определение сроков годности питательных сред

При разработке питательных сред были необходимы исследования их характеристик в процессе длительного хранения для определения сроков их годности. Качество экспериментальных серий питательных сред в процессе хранения их при различных температурах оценивали по физико-химическим и биологическим показателям.

Эксперимент по определению срока годности разрабатываемых сред Эйкмана с лактозой и глюкозой, Кесслера-ГРМ, SDS-бульона показал, что особо значимых изменений качественных показателей сред при хранении в течение 36 месяцев не выявлено по сравнению с исходными образцами. По совокупности полученных результатов было доказано, что среды имеют гарантированный срок годности 2 года.

Исследованиями установлено, что питательная среда для идентификации энтеробактерий (железо–глюкозо–лактозного агара с мочевиной) с предложенной технологией подготовки компонентов в течение 18 месяцев не теряет своих физико-химических и биологических свойств, что соответствует гарантийному сроку хранения - 1 год.

^ Использование экспресс анализаторов «Бак Трак 4100» для оптимизации составов и оценки качества сред Эйкмана

Так как разрабатываемые среды Эйкмана по своим свойствам соответствуют требованиям, предъявляемым к импедансным питательным средам (абсолютная прозрачность и оптимальный ионный состав), нами исследована возможность использования приборов типа «Бак Трак 4100» для определения качества сред Эйкмана по показателям чувствительности и скорости роста E.coli в исследуемых образцах в сравнении со средой Eijkman Lactose Broth (пр-во HI MEDIA) (рисунок 2).

На рисунке 2 приведены типичные кривые импедансного сигнала при определении E.coli с использованием сред Эйкмана с лактозой и глюкозой в сравнении со средой Eijkman Lactose Broth. Видно, что эффективность и скорость роста кишечной палочки на разработанных средах Эйкмана по сравнению со скоростью роста на контрольной среде выше, что подтверждено классическим методом высева на плотные питательные среды.

Кроме того, при росте тест-штаммов наблюдалось изменение цвета питательной среды с исходного зеленого на желтый, что дополнительно позволяет исключить вариабельность интерпретации результатов по сравнению с контрольной средой Eijkman Lactose Broth без индикатора. Таким образом, использование прибора для определения эффективности, скорости роста накопительных сред на примере сред Эйкмана, позволяет исключить рутинный классический метод.



^ Рис.2. Кривые импедансного сигнала при определении E.coli с использованием сред Эйкмана с лактозой и глюкозой в сравнении с аналогом.

Применение радиационного метода стерилизации и индивидуальной упаковки для сред Эйкмана

В отечественной промышленности отсутствуют сухие накопительные питательные среды в стерильной расфасовке для непосредственного внесения в определенный объем воды при использовании в полевых условиях. Нами предложен алгоритм подготовки сред Эйкмана для эпидемиологического мониторинга, который включает одноразовую индивидуальную упаковку и стерилизацию γ- облучением. Сухие среды Эйкмана с лактозой (глюкозой), рассчитанные на исследование 100 мл воды, были расфасованы и герметично укупорены во флаконы из полистирола и стекла для стерилизации γ-облучением на кобальтовой стационарной водоохлаждаемой установке КСВ-500. Экспериментально установлена оптимальная минимальная доза в 5 кГр, достаточная для стерилизации сухих питательных сред.

Таким образом, сухие питательные среды Эйкмана с лактозой (глюкозой) в индивидуальной упаковке имеют дополнительное преимущество: просты и удобны в приготовлении для использования в стационарных и передвижных лабораториях и могут быть рекомендованы для применения в практику здравоохранения для повышения эффективности эпидемиологического мониторинга объектов внешней среды (воды).

^ Разработка нормативной документации

В связи с необходимостью совершенствования диагностики возбудителей кишечных инфекций на питательных средах нами были разработаны ТУ, регламенты производства, инструкции по применению для установления единых норм, требований и показателей качества питательных сред, а также единых методов испытания этих показателей и требований к упаковке, маркировке, транспортированию, хранению. Результатом разработки нормативной документации является внедрение в производство усовершенствованных питательных сред.

^ Разработка методических рекомендаций

В России широко применяется методология обнаружения и выявления БГКП с применением бактериологических питательных сред лабораторного изготовления при санитарно-микробиологическом исследовании объектов внешней среды, пищевых продуктов, оборудования предприятий пищевой промышленности, для оценки санитарного состояния лечебных учреждений, учреждений общественного питания и т.д.

Разработан проект методических рекомендаций по использованию усовершенствованной, сухой питательной среды Эйкмана с лактозой при санитарно-микробиологическом анализе воды для обнаружения колиформных бактерий и E.coli. Присутствие и подсчет количества общих колиформных бактерий (ОКБ) и термотолерантных колиформных бактерий (ТКБ) определяют титрационным методом (методом бродильных проб), который может быть использован при отсутствии материалов и оборудования для выполнения анализа методом мембранной фильтрации; при анализе воды с большим содержанием взвешенных веществ; в случае преобладания в воде посторонней микрофлоры, препятствующей получению на фильтрах изолированных общих колиформных бактерий. Метод основан на накоплении бактерий после посева установленного объема воды в жидкую питательную среду с последующим пересевом на плотную дифференциальную среду с лактозой и идентификации колоний по культуральным и биохимическим тестам. Для ускорения выдачи ответа на присутствие ТКБ рекомендовано производить высев 1 мл из объемов среды Эйкмана, где отмечено помутнение, газообразование и изменение цвета среды, в пробирки со средой Эйкмана, предварительно прогретой до 44 С, с поплавками. Посевы выдерживают в термостате при (44±1) С в течение (24±2) часов. При обнаружении кислоты и газа выдают положительный ответ.

^ Испытание разработанных питательных сред в баклабораториях

На завершающем этапе работы образцы разработанных питательных сред были совместно испытаны на базах микробиологических лабораторий.

При исследовании проб из водоисточников на ТКБ с использованием разработанных сред Эйкмана с лактозой и глюкозой на базе микробиологической лаборатории ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Калужской области» было отмечено, что испытуемые среды при различных температурах инкубирования (37 и 44) С в течение 24 ч. дают характерный рост БГКП. Выявляемость энтеробактерий 100 %.

Испытания сред Эйкмана с лактозой проводились при санитарных обследованиях предприятий общественного питания, воды поверхностных водоемов и сточных вод, пищевых продуктов (молоко и молочнокислые продукты, кондитерские изделия с кремом). Всего было исследовано 623 молочных продукта, в 68 были обнаружены БГКП; 756 смывов – из них 120 положительных находок; 46 поверхностных водоемов – 8 находок; 30 колодцев и родников – 12 положительных находок. На среде Эйкмана с глюкозой общее количество исследований - 756 из них 128 положительных находок при 100 % совпадении с контрольными средами.

Проведенные испытания качества питательных сред Эйкмана в ФГУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора показали, что выявляемость энтеробактерий в исследуемых образцах воды на средах Эйкмана с глюкозой и лактозой также составила 100 %, скорость роста энтеробактерий на испытуемых средах сопоставима со скоростью роста на контрольной среде Кесслера-ГРМ, биохимические и культуральные свойства микроорганизмов стабильны. Чувствительность сред Эйкмана с глюкозой и лактозой (при посеве 19 штаммов энтеробактерий, в том числе в посевной дозе <102 микробных клеток, инкубации в течение 24 – 48 часов) составила 100 %.

При испытании среды Кесслера-ГРМ в качестве контроля использовалась среда Кесслера лабораторного изготовления. Посев материала осуществлялся на среды с соблюдением условия равнозначности. Посевы инкубировались при температурах (37 и 43)С в течение 24 ч.

По результатам апробации среды Кесслера ГРМ, проведенной в централизованной микробиологической лаборатории ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Тульской области», было отмечено, что при посеве исследуемых образцов как в экспериментальную среду, так и в среду лабораторного изготовления отмечался рост в виде помутнения и образования газа при наличии БГКП (таблица 2).

Аналогичные испытания среды Кесслера-ГРМ были проведены в лаборатории ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии по Калужской области». Было исследовано 2175 проб в виде смывов, пищевых продуктов и т. д. В ходе исследований установлено, что выявляемость культур на среде Кесслера – ГРМ выше по сравнению с контрольной и составляет 103 % (таблица 3).

Таблица 2 - Результаты проверки качества среды Кесслера-ГРМ

Наименование
учреждения

Кол-во посевов / выделено культур

Виды культур и кол-во

Смывы

ЛПУ

50/4

E. coli – 2

K. pneumoniae – 1

S. infantis - 1

Детские комбинаты

95/19

E. coli - 12

K. pneumoniae – 3

C. freundii -4

Предприятие общ. питания

40/24

E. coli -9

K. pneumoniae -15

Предприятие пищевой промышленности

10/0




Пищевые продукты







Детские учреждения

9/5

E. coli - 3

K. oxytoca - 2

Предприятие общ. питания

3/1

^ K. pneumoniae

Молокозавод

11/0

-


Таблица 3 - Выявляемость БГКП при посеве объектов внешней среды.

Выявленные штаммы при испытаниях

Исследуемая среда
Кесслера-ГРМ

Среда Кесслера
лабораторного изготовления

Количество посевов

2715

2715

Количество находок

103

100

БГКП, в т.ч.

98

95

E. coli Lac‾

41

40

^ K. pneumoniae

1

1

K. oxytoca

8

8

E. aerogenes

9

9

^ E. cloacae

8

8

C. diversus

3

3

C. freundii

14

14

Итого, %:

103

100

Не энтеробактерии







^ P. aeruginosa

5

5


Результаты проведенных исследований на всех базах показали, что среда Кесслера-ГРМ проста, удобна в приготовлении, стандартна, обладает высокой чувствительностью в отношении БГКП.

Испытания SDS-бульона по микробиологическим показателям (по выявляемости энтеробактерий в образцах воды, смывов и др.), были проведены в Центре Госсанэпиднадзора г.Серпухова и в лаборатории ФГУЗ «Центр ГиЭ по Калужской области» (таблица 4).

Таблица 4 - Выявляемость энтеробактерий на SDS-бульоне (по результатам на двух базах).

Выявленные штаммы при испытаниях

Испытуемая среда SDS-бульон

Контрольная среда Кода

Количество посевов

702

702

Количество положительных находок энтеробактерий, в т. ч.

101

87

E. coli Lac+

49

40

^ C. freundii

11

22

C. diversus

2

1

K. pneumoniae

26

22

^ S. infantis

1

1

K. oxytoca

2

2

E. cloacae

2

2

^ E. aerogenes

2

2

E. coli Lac‾

4

4

Выявляемость энтеробактерий, % в т. ч.

116,1

100

E. coli Lac+

123

100

^ C. freundii

100

100

C. diversus

100

100

K. pneumoniae

118

100

^ S. infantis

100

100

K. oxytoca

100

100

E. cloacae

100

100

^ E. aerogenes

100

100

E. coli Lac‾

100

100


В результате проведенных экспериментов установлено, что по чувствительности, скорости роста энтеробактерий, ингибирующим свойствам в отношении микробов – ассоциантов, сохранности основных биологических показателей выделенных энтеробактерий испытуемая среда SDS-бульон идентична контрольной - среде Кода (филиал ФГУП НПО «Микроген» г. Махачкала). Но по выявляемости энтеробактерий разработанная среда показала преимущество перед контрольной средой - 116.1 %.

Испытания железо-глюкозо-лактозного агара с мочевиной, проведенные в лаборатории ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Тульской области» с использованием музейных, свежевыделенных штаммов, биоматериала от больных, шовного и перевязочного материала при исследовании его на стерильность, показали хорошие идентифицирующие свойства и предпочтительное ее использование перед средой Клиглера, (выявлено на 4 находки больше или 122 %, вследствие дополнительного теста по расщеплению мочевины) (таблица 5).

Таблица 5 - Выявляемость энтеробактерий на испытуемой и контрольной средах при посеве клинического материала

Выявленные штаммы при испытаниях


Питательная среда
(железо-глюкозо-лактозный агар с мочевиной)

Контрольная среда Клиглера-ГРМ

Количество посевов

856

856

Количество положительных находок:

22

18

Sh. flexsneri 2a

15

15

^ S. enteritidis

3

3

Pr.reffgeri

3

-

K. pneumoniae

1

-


Питательные среды Эйкмана с лактозой и глюкозой, флюорогенный селективный бульон и железо-глюкозо-лактозный агар с мочевиной успешно прошли апробацию при микробиологических исследованиях материала от больных, при вспышке бактериальной инфекции в г.Абакане в 2008 г.

Образцы испражнений из ДДУ г.Абакана (при вспышке менингококковой инфекции) были доставлены в ФГУН ГНЦ ПМБ для выявления наличия патогенных энтеробактерий.

Первичный материал был посеян для накопления и выделения на среды Эйкмана с лактозой и глюкозой, ФСБ, агар Эндо, Сорбитол E.coli 0157:Н7 агар, иерсиниозную среду. Инкубацию проводили при температуре 37 °С в течение 18 ч. В результате полученных исследований на питательных средах, в том числе и на средах Эйкмана с глюкозой и лактозой, железо-глюкозо-лактозный агар с мочевиной и на флюорогенном селективном бульоне, было подтверждено наличие колиформных бактерий E.coli во всех образцах, кроме одного образца, что указывает на высокую степень дисбактериоза кишечника.

Заключение

Представители семейства Enterobacteriaceae (энтеробактерии) играют важнейшую роль в патологии человека, вызывая инфекционные процессы различной тяжести. Идет интенсивный процесс детализации таксономического положения отдельных родов и видов, выявление и описание новых. Поэтому, вполне естественно, что и бактериологам, и клиницистам приходится следить за новой информацией. Многие редкие виды не включены в базы данных наиболее распространенных коммерческих тест-систем, что затрудняет идентификацию этих микроорганизмов. Облегчает ситуацию тот факт, что использование бактериологического метода с применением набора питательных сред остается «золотым стандартом» обнаружения, выделения и идентификации микроорганизмов с типированием их родовой и видовой принадлежности.

Наиболее широко известным и распространенным способом решения данной проблемы является применение сред для первичной дифференциации.

Целью использования таких сред является накопление чистой культуры и одновременная дифференциация, основанная на регистрации некоторых биохимических свойств бактерий, что позволяет упростить процедуру дальнейшей идентификации за счет сужения круга подозреваемых микроорганизмов.

Основным результатом диссертационной работы явилась разработка и внедрение в производство новых и усовершенствованных диагностических препаратов для оценки санитарно-эпидемического состояния объектов внешней среды, клинического материала и пищевых продуктов на наличие колиформных микроорганизмов. С этой целью разработаны сухие, стандартные, высокочувствительные, пригодные к использованию как в лабораторных, так и в полевых условиях диагностические питательные среды для первичной идентификации микроорганизмов: среды Эйкмана с лактозой и глюкозой, среда Кесслера-ГРМ, SDS-бульон, железо-глюкозо-лактозный агар с мочевиной, флюорогенный селективный бульон (ФСБ).

За период с 01.01.07. по 31.10.09. в ФГУН ГНЦ ПМБ произведено SDS-бульона – 7800 кг, среды Кесслера-ГРМ – 8000 кг, железо-глюкозо-лактозного агара с мочевиной – 6000 кг.

Предложена современная методология контроля водоисточников с использованием стерилизованных γ-облучением сред Эйкмана в одноразовой индивидуальной упаковке при применении в стационарных и передвижных лабораториях.

В отличие от препаратов сравнения, разработанные среды Эйкмана с глюкозой и лактозой содержат индикатор бромтимоловый синий, что дает возможность более точно интерпретировать результаты анализа.

Применение железо-глюкозо-лактозного агара с мочевиной позволяет дифференцировать микроорганизмы по способности продуцировать сероводород, расщеплять мочевину и утилизировать глюкозу.

Для экспресс индикации и сокращения времени исследования по выявлению колиформных бактерий разработан флюорогенный селективный бульон (ФСБ), принцип действия которого основан на способности E.coli расщеплять флюорогенный субстрат, благодаря наличию β-клюкуронидазы, с визуальным определением продуктов реакции.

Таким образом, внедрение в производство вышеуказанных питательных сред, разработка методических рекомендаций по их применению, способствует эффективному обнаружению и дифференциации колиформных микроорганизмов в исследуемых материалах.


8169846952872249.html
8170065095039564.html
8170177303246637.html
8170345610756030.html
8170493103087236.html